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过氧亚硝基阴离子（ONOO-）检测试剂盒是一种利用荧光探针O71进行过氧亚硝基阴离子检测的试剂盒。O71探针本身没有荧光，可以自由穿过细胞膜，进入细胞内后，在过氧亚硝基阴离子存在的条件下，O71探针被氧化生成荧光物质O71F，O71F的绿色荧光强度与细胞内过氧亚硝基阴离子水平成正比，检测O71F绿色荧光就可以知道细胞内过氧亚硝基阴离子的水平。本试剂盒可以用于各种真核培养细胞的检测。

在激发波长488nm，发射波长516nm附近，使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜、荧光分光光度计、荧光酶标仪、流式细胞仪等检测O71F荧光，从而测定细胞内过氧亚硝基阴离子水平。

O71荧光探针对过氧亚硝基阴离子（ONOO-）有较高的选择性，但是也会与活性羟基反应。

• 使用方便：可用激光共聚焦显微镜直接观察、荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测；
  
• 背景低，灵敏度高；
  
• 线性范围宽，使用方便。

• 试剂A为DMSO溶液，冬季气温较低时为凝固状态，极易粘附在管壁、吸头壁。注意需要加热融解，变成液体状态后离心至管底部再开盖。
  
• 可以用手捂住使其融解或37℃短时间水浴。吸头也需要放在培养箱预热，否则容易再次凝固在吸头内壁产生损耗。

• 激光共聚焦显微镜或荧光分光光度计或酶标仪或流式细胞仪，激发波长488nm，发射波长515±5nm。或者按照FITC荧光检测条件检测。
  
• 离心机、PBS缓冲液、HBSS（无酚红）

• 螺旋盖微量管装的试剂在开盖前请短暂离心，将盖内壁上的液体收集至管底，避免开盖时液体洒落。
  
• 荧光探针标记后，一定要洗净残余的未进入细胞内的探针，否则会导致背景较高。
  
• 探针标记完毕并洗净残余探针后，可以进行激发波长的扫描和发射波长的扫描，以确认探针的标记情况是否正常。
  
• 尽量缩短探针标记后到测定所用的时间，以减少各种可能的误差。
  
• 对于药物作用时间较短(小于2小时)的细胞，可以先标记探针，后用药物刺激细胞。对于药物作用时间较长(6小时以上)的细胞，先用相应的药物刺激细胞，后标记探针。
  
• 使用前，先将本品取出回温至室温，并对其进行简短离心使DMSO溶液集中于管底。
  
• 细胞处理需要小心操作，尽量避免人为的损伤细胞。
  
• 标记的条件因细胞种类而异，根据不同样本的实际染色结果做相应调整，在每次实验前，请先根据不同的实验要求、细胞类型、细胞的膜通透性等进行优化，确定最佳条件。以下方法仅供参考。
  
• 酚红对O71荧光探针的检测有干扰，需避免。
  
• 染色后立即进行分析。
  
• 以下步骤仅做为参考，稀释比例和孵育时间可根据实际情况来调整。比如，对于某些细胞，如果发现未被刺激的阴性对照细胞荧光也比较强，可降低探针浓度。如果发现用感兴趣的药物刺激后荧光较弱，可升高O71探针浓度，以提高检测的灵敏度。另外，探针装载的时间也可以根据情况在15～60分钟内适当进行调整，孵育温度在4℃～37℃内调整。

• 探针染色工作液配制：
  根据样本数量，用HBSS将O71荧光染料100～500倍稀释，配制成染色工作液。
  
  • 建议收到产品后，根据单次使用量，对母液进行分装，每次使用一管，试剂-20℃避光冻存，一年稳定。
    
  • 开始实验前，使用HBSS缓冲液或PBS稀释储存液到需要的工作浓度。工作浓度为根据不同细胞的预实验结果确定的最佳工作浓度，一般染色终浓度100～1000倍稀释。200倍稀释适合大多数细胞样本。
    
  • 为了降低过度加载染料导致的潜在背景和线粒体毒性，在不影响实验结果的前提下应尽可能低浓度染色。另外，浓度过高也可能造成非特异性染色，对其他细胞结构进行染色。
    
  • 工作液现配现用。
• 细胞探针标记：
  
  • 对于贴壁细胞，可以进行原位标记
    
    • 培养皿/培养板准备细胞样本。
      
    • 待细胞生长到合适丰度，吸除培养液，加入适量37℃预热的含探针工作液。于生长状态下孵育20分钟～30分钟（具体孵育时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
      
      • 也可以将细胞置于培养皿中的盖玻片上，加入合适培养基，使其爬片生长。
    • 移除染色液，用PBS(pH7.4)洗涤细胞3次。
      
      • 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
    • 荧光显微镜(含合适滤片)或流式细胞仪、荧光酶标仪下观察。最大激发/发射波长为488/516nm。
  • 对于悬浮细胞
    
    • 离心，吸除上清。
      
    • 利用37℃预热的探针工作液100～200μL重悬细胞，于生长状态下孵育20分钟～30分钟（具体时间需根据细胞类型而定，需预实验优化）。
      
    • 离心，吸除染色液，加入PBS（pH7.4）重悬细胞，洗涤3次。
      
    • 流式细胞仪、荧光酶标仪检测。最大激发/发射波长为488/516nm。
      
      • 对于悬浮细胞，也可将细胞贴附于经细胞粘合剂处理过的盖玻片上，然后使用类似于贴壁细胞的方法进行染色。
        
      • 如果需要盖玻片上固定化的细胞，那么可在铺片前可以先用多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被载玻片或盖玻片。
        
      • 若染色不够充分，建议增加染料浓度或延长染色时间。
• 检测：
  对于原位标记探针的样品可以用荧光显微镜，激光共聚焦显微镜直接观察，或收集细胞后用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测。对于收集细胞后标记探针的样品可以用荧光分光光度计、荧光酶标仪或流式细胞仪检测，用激光共聚焦显微镜直接观察亦可。
  使用488nm激发波长，516nm发射波长，实时或逐时间点检测刺激前后荧光的强弱。
  O71F的荧光光谱和FITC非常相似，可以用FITC的参数设置进行检测。